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大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化

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文章附图

图片介绍

图1 关节软骨来源祖细胞的细胞形态、增殖能力及流式细胞鉴定结果

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结果:在倒置显微镜下观察,经过纤连蛋白分选后的ACPCs均为中间宽两边细长的短梭形,与间充质细胞的典型细胞形态类似。随着细胞代次的增加,在相同时间内ACPCs的细胞密度逐渐降低,但在细胞形态上未有明显改变,见图1A

CCK-8结果显示,同一代次ACPCs的吸光度值随着培养时间延长持续升高;同一时间ACPCs的吸光度值在原代最高,其次是第1代,最后是第2代,培养13579 d时原代与第1代,第1代与第2代差异均有显著性意义(P < 0.05),见图1B

纤连蛋白分选后获得的大鼠ACPCs进行流式细胞鉴定,流式细胞仪计数结果显示:间充质细胞标志物CD29CD73表达为强阳性,分别为96.8%94.2%CD90CD105表达为阳性,分别为40.6%67.0%,软骨来源祖细胞备选特异性标志物Notch-1表达为阳性,为33.7%;非干细胞标志物CD31CD44CD45表达弱阳性或阴性,分别为3.17%5.15%1.85%,见图1C


图2 关节软骨来源祖细胞克隆形成实验

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结果:在各个代次细胞培养皿底部均有多个ACPCs单细胞克隆形成,见图2A。随后对不同代次细胞形成的克隆数进行比较,可见随着细胞代次的增加,ACPCs克隆数明显下降。对直径大于2 mm的克隆进行计数,不同代次之间差异有显著性意义(P < 0.000 1),见图2B



图3 关节软骨来源祖细胞及骨髓间充质干细胞的成骨诱导结果

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结果:在肉眼下观察,ACPCs成骨诱导组橙红色范围随着代次增加逐渐减少。原代橙红色范围为孔中心及周围,颜色较深;第1代仅孔周围有部分橙红色区域,中心为蓝色区域;第2代孔内基本为浅蓝色区域。BMSCs成骨诱导组在原代、第1代和第2代均可见孔内区域为橙红色,橙红色范围随着细胞代次增加未见明显改变,见图3A

ACPCsRT-PCR结果显示,成骨诱导组的成骨相关基因AKPosteocalcin均明显高于非诱导组,差异有显著性意义(P < 0.05),成骨相关基因在不同代次之间是逐渐降低的,在原代与第1代之间的降低幅度尤为明显,AKPosteocalcin的表达在原代与第1代之间差异无显著性意义(P > 0.05),在第1代与第2代之间差异无显著性意义(P > 0.05),但原代与第2代之间差异有显著性意义(P < 0.05),见图3B

BMSCsRT-PCR结果显示,AKPosteocalcin的表达在原代与第1代、第1代与第2代之间差异无显著性意义(P > 0.05),原代与第2代之间差异也无显著性意义(P > 0.05),见图3C



图4 关节软骨来源祖细胞及骨髓间充质干细胞的成软骨诱导结果

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结果:在成软骨诱导21 d后,对细胞团块进行组织学染色分析,ACPCs成软骨诱导组细胞团块中有软骨组织典型结构,即软骨陷窝产生;Ⅱ型胶原染色可见ACPCs构建的团块全部为棕色阳性染色,不同代次之间阳性染色没有明显差异。BMSCs成软骨诱导组细胞团块中仅有部分区域有软骨陷窝产生;Ⅱ型胶原染色可见BMSCs构建的团块大部分组织为棕色阳性染色,且阳性染色区域随着细胞代次的增加而减少,到第2代时Ⅱ型胶原染色明显降低,见图4A

ACPCsRT-PCR结果显示,成软骨诱导组成软骨相关基因AggrecanCOLⅡ、SOX9均明显高于非诱导组,差异有显著性意义(P < 0.05)AggrecanCOL-Ⅱ、SOX9的表达在原代与第1代之间及第1代与第2代之间表达有减低,但基因表达差异无显著性意义(P > 0.05),原代与第2代之间差异也无显著性意义(P > 0.05),见图4B

BMSCsRT-PCR结果显示,成软骨诱导组成软骨相关基因AggrecanCOL-Ⅱ、SOX9均明显高于非诱导组,差异有显著性意义(P < 0.05)AggrecanCOL-Ⅱ、SOX9的表达在原代与第1代及第1代与第2代之间表达有减低,基因表达差异均无显著性意义(P > 0.05),但在原代与第2代之间差异有显著性意义(P < 0.05),见图4C


图片来源

沈 序,陆英杰,路冬冬,方跃鹏,周乃慧,朱雪松,朱月倩. 大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3364-3370.


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文题释义


关节软骨来源祖细胞:是一种主要位于关节软骨表层的软骨细胞,占软骨细胞含量的0.1%-1%,同时具有间充质细胞和软骨细胞的特点。关节软骨来源祖细胞具有比其他间充质细胞更强的软骨分化能力,同时其成骨分化能力有限,是软骨组织工程的理想种子细胞。

纤连蛋白分选:纤连蛋白是从动物血清中提取的一种蛋白质,最早是将其铺板用于皮肤干细胞的分离提纯,后发现可通过纤连蛋白黏附从软骨细胞中获得一批具有强增殖能力的软骨来源祖细胞,其差异性黏附机制可能是由于软骨来源祖细胞表达更高水平的整合素α5β1,可特异性地和纤连蛋白结合。


文章摘要

背景:关节软骨来源祖细胞具有较强的软骨分化能力,同时其成骨分化能力有限,但是经过扩增后其细胞特性是否会发生改变及如何改变目前仍没有相关报道。

目的:观察不同代次关节软骨来源祖细胞增殖、成骨和成软骨能力的改变情况,并与骨髓间充质干细胞相比较。

方法:利用纤连蛋白分选从关节软骨细胞中获得关节软骨来源祖细胞。通过克隆形成实验和CCK-8实验观察关节软骨来源祖细胞增殖能力改变;通过茜素红染色和成骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的变化;通过Ⅱ型胶原免疫组化染色和成软骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成软骨分化潜能的变化。

结果与结论:①通过纤连蛋白分选可从关节软骨细胞中获得具有干细胞特性的关节软骨来源祖细胞,其具有较强增殖能力以及成骨、成软骨分化潜能;②CCK-8和克隆形成实验结果显示随着细胞代次的增加,关节软骨来源祖细胞增殖能力略有下降;③骨髓间充质干细胞具有较强的成骨分化潜能,并且随着细胞扩增未有明显改变,成软骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低;④关节软骨来源祖细胞具有较强的成软骨潜能,并且随着细胞扩增未有明显改变,成骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低;⑤结果表明,关节软骨来源祖细胞的成骨潜能明显低于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增逐渐减低,成软骨潜能高于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增成软骨能力未有明显改变,说明关节软骨来源祖细胞可能是一种更加理想的软骨组织工程种子细胞。


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http://www.crter.org/CN/article/openArticlePDF.jsp?id=14740