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血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活

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文章附图

图片介绍

图1 术前背部设计 8 cm×2 cm 随意型皮瓣,根据术前设计切开、分离皮瓣

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结果:实验动物在术前12 h开始禁食准备,用100 g/L水合氯醛3 mL/kg剂量腹腔注射麻醉后俯卧位固定,鼠背术区用硫化钠(10%)脱毛,碘伏、乙醇消毒,铺巾。在大鼠背部正中线左右两侧分别设计2个对称的超长宽比例随意皮瓣模型(8 cm×    2 cm),皮瓣模型蒂部位于髂棘水平,见图1


图2 实验试剂注射点示意图,皮瓣大小 8 cm×2 cm,红色小圆点为试剂注射点

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结果:将30只SD大鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组10只,其背部皮瓣按左右位置分成Ⅰ-left,Ⅰ-right,Ⅱ-left、     Ⅱ-right,Ⅲ-left、Ⅲ-right,其中Ⅰ-left、Ⅱ-left注射LG-DMEM培养基划分为对照组,Ⅰ-right、Ⅲ-left注射人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组1,Ⅱ-right、Ⅲ-right注射转染血管内皮生长因子基因的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组2,见表1。实验选择在皮瓣纵向中心轴线距离皮瓣蒂部3,4,5,6,7 cm的中远位置作为注射点,顺应了皮瓣模型的术后病理生理学变化。皮瓣掀起后立即分别用1 mL注射器抽取实验溶液,在皮瓣中、远部位,从筋膜面向肉膜层和真皮层内注射,一个皮瓣共5点(每点注射0.1 mL,细胞浓度为1×107 L-1),见图2



图3 人羊膜间充质干细胞生长形态

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结果:体外分离、培养获得的第3,4代人羊膜间充质干细胞多呈梭形或多角形,贴壁呈漩涡、网状或辐射状排列生长,单层扁平分布,形态与成纤维细胞类似,见图3



图4 流式细胞仪检测人羊膜间充质干细胞表面标志分子表达

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结果:流式细胞仪分析结果表明,人羊膜间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD166,不表达造血系统和内皮系统抗原标记CD34、CD45,见图4


图5 转染 pCMV-VEGF165-eGFP 的人羊膜间充质干细胞在荧光显微镜下呈现加强型绿色荧光蛋白报告基因表达(×400)

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结果:Lipofectamine 2000介导pCMV-VEGF165-eGFP转染人羊膜间充质干细胞12 h后,荧光显微镜下可观察到部分人羊膜间充质干细胞内有少量绿色荧光蛋白表达,胞质、胞核内均有绿色荧光蛋白分布,间接反映pCMV-VEGF165- eGFP转染成功,转染效率为5.53%。伴随时间的延长,绿色荧光蛋白在人羊膜间充质干细胞内的分布也逐渐增多,表明转染效率较高。绿色荧光蛋白在转染后72 h表达明显增多,96 h时也持续较高的表达,见图5。12,24,48,72,96 h的转染率分别为5.53%,13.37%,32.37%,43.62%,48.08%,差异有显著性意义(P < 0.05),选择转染效率相对高的时间点(96 h)的人羊膜间充质干细胞用于实验。



图6 人羊膜间充质干细胞的 CM-Dil 标记效果(荧光显微镜,×400)

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结果:荧光显微镜观察发现,标记CellTrackerTM CM-DiI的人羊膜间充质干细胞发红色荧光,呈球形(经消化、重悬),胞浆丰富,CellTrackerTM CM-DiI标记人羊膜间充质干细胞阳性率高,见图6



图7 术后 7 d 各组大鼠皮瓣大体观察

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结果:实验组2超长缺血皮瓣模型成活率明显高于实验组1和对照组,实验组1超长缺血皮瓣模型成活率明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、    Ⅰ-right和Ⅲ-left、Ⅰ-left和Ⅱ-left之间皮瓣成活率差异无显著性意义(P > 0.05),见图7


图8 术后 7 d 各组皮瓣组织学观察(苏木精-伊红染色,×200)

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结果:实验组2超长缺血皮瓣模型微血管断面密度明显高于实验组1和对照组,实验组1超长缺血皮瓣模型微血管断面密度高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、    Ⅰ-right组和Ⅲ-left、Ⅰ-left和Ⅱ-left之间微血管断面密度差异无显著性意义(P > 0.05),见表5图8



图9 移植人羊膜间充质干细胞在体内的存活和增殖情况(×400)

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结果:在荧光显微镜下观察,对照组未见红色荧光,实验组1和实验组2均可见红色荧光,可以认为其是经CellTrackerTM CM-DiI标记的人羊膜间充质干细胞,见图9,表明植入体内的人羊膜间充质干细胞可存活和增殖。



图10 Western blot 检测各组大鼠皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达

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结果:各组皮瓣组织内血管内皮生长因子表达均呈阳性,实验组2超长缺血皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于实验组1和对照组,实验组1超长缺血皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于对照组,差异均有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、Ⅰ-right 和Ⅲ-left、Ⅰ-left 和Ⅱ-left之间皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05),见图10表6


图片来源

金文虎,周爱婷,吴中桓,范振海,王达利,魏在荣. 血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3349-3356.


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文题释义


人羊膜间充质干细胞:与间充质干细胞相似的表面标志,在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的间充质细胞,具有间充质干细胞的共性,有减轻炎症反应、促进肉芽组织沉积、促进再上皮化及血管生成作用。

血管内皮生长因子:是一种高度特异性的促血管化生长因子,具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用,被认为是目前研究血管生成的热点因子。


文章摘要

背景:研究证实血管内皮生长因子能够诱导新生血管形成,人羊膜间充质干细胞也可通过多种机制改善皮瓣移植的缺血再灌注损伤。因此,用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞为促进皮瓣成活提供了可能。

目的:探索局部应用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞对超长比例随意皮瓣成活的影响。

方法:将30只成年SD大鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组10只,在其背部左右分别构建2 cm×8 cm超长缺血随意皮瓣模型,皮瓣蒂部位于髂棘水平,分别为Ⅰ-left,Ⅰ-right,Ⅱ-left,Ⅱ-right,Ⅲ-left,Ⅲ-right。皮瓣掀起后即刻,Ⅰ-left、Ⅱ-left注射0.5 mL LG-DMEM培养基划分为对照组,Ⅰ-right、Ⅲ-left注射0.5 mL细胞浓度为1×109 L-1的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组1,Ⅱ-right、Ⅲ-right注射0.5 mL细胞浓度为1×109 L-1转染血管内皮生长因子基因的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组2,每个皮瓣共注射5点,每点注射0.1 mL。移植后即刻、2448 h以及47 d,激光多普勒血流监测仪监测皮瓣中部和蒂部的血流灌注值,移植后7 d观察各组皮瓣的成活率,取成活皮瓣组织通过组织学观察各组皮瓣毛细血管密度,荧光显微镜观察人羊膜间充质干细胞在皮瓣内的分布及存活状况,Western blot检测皮瓣组织中血管内皮生长因子蛋白水平。

结果与结论:①实验组2皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于实验组1及对照组,实验组1皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05);②在荧光显微镜下观察发现,实验组1、实验组2皮瓣组织内有CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞;③各组皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达均呈阳性,实验组2皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于实验组1及对照组,实验组1皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05);④结果证实,在超长随意皮瓣中、远部位应用人羊膜间充质干细胞可明显改善皮瓣成活率;人羊膜间充质干细胞经血管内皮生长因子基因转染后能够分泌更多的血管内皮生长因子蛋白,进而促进超长随意皮瓣血管新生,提高皮瓣成活率。


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